液相色谱流动相溶剂离线混合的注意事项
你很少会遇到高效液相色谱法在整个运行过程中使用单一溶剂的方法。保存在流动相储层中的纯溶剂需要在等容条件下按要求的比例混合。
溶剂的混合是一个关键步骤，因为程序偏差会影响色谱图和分析。
混溶的溶剂
溶剂的混溶性与它们的极性直接相关。记住“物以类聚”。要混合的溶剂应在所有比例下相互混溶，因为不混溶或部分混溶的溶剂不能用于HPLC分析。常用的溶剂如水、甲醇、乙腈、四氢呋喃等彼此完全混溶，常用于反相分离。
温度效应
溶剂的密度随温度的变化而变化，进而影响分配的体积。为保证良好的重现性，溶剂瓶在混合前应在实验室室内保存一段时间，以稳定到实验室温度。
溶剂很少按化学计量进行混合，而且混合时所占体积小于混合前各自体积之和。此外，由于混合，温度会发生变化，从而导致体积的变化。甲醇与水混合会导致加热，而乙腈和水混合会导致冷却。为了补偿在相同的混合顺序上的热变化，每次都应遵循相同的混合顺序。最好是分别测量所需的体积并将它们混合，而不是将一种溶剂的体积放入量筒或容量瓶中，然后将另一种溶剂的体积补到刻度处。
纯度
应使用高效液相色谱级溶剂。在商业上，这种分级是通过蒸馏AR级溶剂然后过滤制备的。水应该是高纯度的，并且可以使用基于商业上可用的反渗透系统来获得。参见高效液相色谱法用水要求的链接。
紫外截止波长
当使用紫外检测器时，紫外截止波长是决定哪种HPLC溶剂可以混合的重要考虑因素。紫外截止指定紫外检测器可用于特定溶剂的最低波长。以下是一些常用溶剂的截止值:
| 溶剂 | 紫外线切断(nm) |
| 甲醇 | 205 |
| 水 | 190 |
| 乙腈 | 190 |
| 四氢呋喃 | 212 |
| 己烷 | 195 |
折射率
使用RI检测器时，在混合溶剂前应考虑溶剂的折射率。样品的折射率应尽可能地与流动相的折射率不同，以获得显著的响应
粘度
溶剂应具有低粘度，以有效地流动和传质分析物进出固定相孔。粘稠的溶剂也会导致高柱背压。
压缩系数
有些溶剂比其他溶剂更容易压缩。高效液相色谱在高压下工作，由于溶剂的可压缩性，流量会产生偏差。现代泵送系统正确的溶剂可压缩性，并确保一致的流量。
有害的溶剂
使用安全应该是你最关心的问题。尽量避免使用有毒、易燃或致癌的溶剂。
在本文中，介绍了手动混合流动相的注意事项。随后的一篇文章将介绍在系统中使用低压和高压混合选项的流动相混合。
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