高效液相色谱分离中缓冲液的使用指南

缓冲器扮演着重要的角色反相高效液相色谱分离。pH值的变化影响样品分子的电离程度。

这种变化在非极性分子中是最小的，但在性质为酸性或碱性的极性分子中却是显著的。

改变pH值可以有效地分离紧密间隔的洗脱峰，甚至可能导致分离峰的合并。正是由于这个原因，通过使用缓冲液来控制pH有助于改善紧密间隔或重叠峰的分离。

通过使用缓冲液，有几个关键因素有助于控制pH值，本文将简要介绍这些因素。

缓冲选择

缓冲液的选择取决于缓冲液的特性，如pka,pH值范围和UV截止。这些参数的值可以很容易地在参考文本中找到。

作为一般规则，pH缓冲液应使用在其pka值的+/- 1单位内。在这个范围内，缓冲液抵抗任何故意改变pH值的尝试。例如，pka值为4.8的缓冲液可以在pH值为3.8-5.8的范围内有效使用。紫外截止值也应考虑为检测波长不应干扰缓冲吸光度。

缓冲pH值

硅基色谱柱不应在pH值2.0-8-0范围外使用。pH值低于2.0时，有机结合相可能会丢失，而pH值高于8.00时，固定相硅主链的溶解度会增大。对于此类应用程序列与其他包装可以证明是有用的。

缓冲液浓度

决定缓冲浓度对于方法开发很重要。理想地，应选择提供可重复结果的最低浓度。更高的浓度导致极性分子的更快洗脱。通常，缓冲浓度不应低于0.005m。

低于这个浓度，它可能不能保持作为活性缓冲液。随着缓冲液浓度的提高，缓冲液粘度也会增加，从而增加柱背压力。正常情况下，浓度应保持在0.005 ~ 0.1M范围内。

缓冲溶解度

缓冲液应完全溶解在溶解介质中。在较高的浓度下，可以在与流动相的有机成分接触时进行沉淀。这种沉淀可以导致泵中的操作问题以及柱的阻塞。

缓冲液的制备

称量在体积烧瓶中所需的量，然后开始加入所需的溶剂。在将烧瓶填充到所需标记之前调整溶液的pH。在开始添加所需的有机相之前应进行pH调节。接下来将解决方案过滤到0.45μm过滤器以进行常规分析应用和0.22μm过滤器UHPLC应用程序。

这是必要的清除任何残余固体悬浮液。缓冲液配制后应尽早使用，如果在使用前观察到任何固体或细菌悬浮液，应丢弃并新鲜配制。

可以看出，缓冲区在大多数情况下起着至关重要的作用高效液相色谱法分离。方法的发展通常需要仔细选择缓冲液，并在其制备过程中充分小心。