反相色谱法
讨论高效液相色谱法或俗称高效液相色谱法让我们回到20世纪初。毫无疑问，高效液相色谱已经成为一种重要的分析技术，用于分离、识别或鉴定混合物的成分。
高效液相色谱发现其应用于许多领域，如食品和饮料，法医，临床研究，环境实验室，最重要的是在制药部门。
如果你想掌握关于HPLC的基本概念的知识，我们有一个不同的部分涵盖了几乎所有的其他部分HPLC的分项数据．
这里我们将讨论HPLC分离模式。
极性分离
正常相高效液相色谱法:
正相色谱建立在极性固定相和非极性流动相的分配平衡上。
固定相的极性高于流动相。溶质的保留过程是极性较低的溶质先保留，极性增加的溶质再保留。
一般而言，硅胶由固定相组成，而流动相则由己烷、氯仿、异丙醇等组成。
用途:NPLC在分离过程中发现它的用途，特别是在样品化合物的水溶性受到限制的条件下。它也适用于分离许多类型的异构体，以及在数量或官能团性质上不同的化合物。
反相高效液相色谱法
反相色谱建立在非极性(疏水)固定相和极性流动相的分配平衡上，流动相的极性高于固定相。
与NPC不同的是，更多的极性溶质先被洗脱，然后是极性降低的溶质。
反相色谱原理证实，反相色谱中的分离依赖于溶质分子的可逆吸附/解吸，其疏水性水平改变为疏水性固定相。大多数反相分离实验都是通过几个基本步骤来进行的。
图:梯度洗脱反相色谱原理。(修改图片:参考- 2)
[注:在生物分子的情况下，反相色谱主要使用梯度洗脱，而不是等度洗脱。
等度洗脱是在整个过程中流动相组成保持不变的分离，而梯度洗脱则恰恰相反，因为在分离过程中流动相组成发生了变化。
等度洗脱最适用于简单分离，梯度洗脱适用于复杂样品的分析。
流动相的例子是水或缓冲液(水溶剂)和有机溶剂的混合物，如甲醇、乙腈或四氢呋喃(THF)。
用途:大约80%的高效液相色谱应用都覆盖了RPLC。它用于由不同分子量和/或水溶性成分组成的混合物的分离。
| 的分离模式 | 固定相 | 流动相 |
| 正常的阶段 | 极地 | 非极性 |
| 反相 | 非极性 | 极地 |
表:正常相色谱和反相色谱的相特性
亲水-相互作用色谱(HILIC)
HILIC可视为正相色谱的一种，但其分离机理较NPLC复杂。
hillic可用于等临界或梯度洗脱模式。当添加更多的水(<20%)时，被吸引到极性包装材料颗粒上的极性化合物可以被洗脱，因为流动相的极性增加。分析物的洗脱过程按亲水性增加顺序进行。为了使可电离的分析物保持单一形式，可以将缓冲液或盐附在流动相上。
用途:用于分析高极性物质
疏水相互作用色谱(HIC)
它被认为是一种反相色谱，基于分子的疏水性分离。HIC具有大分子与适度疏水固定相的疏水协作的优势。例如:丁基键[C4]，而不是十八烷基键[C18]，二氧化硅。
蛋白质在HIC介质中吸附所遵循的原理被认为是对离子交换和尺寸排阻色谱的补充。
用途:分离蛋白质，同时保留可能使其变性的生物活性。
电荷分离
离子交换色谱(IEC)
这种分离模式基于电荷，相反电荷的离子相互吸引，而相同电荷的离子可能相互排斥。IEC的基础是离子交换器和离子溶质之间的静电相互作用。
所述固定相为酸性或碱性，具有负电荷或正电荷，而所述流动相由极性液体构成，如水中的盐溶液。这种分离是由于分子与带电固定相之间的吸引力离子力造成的。
如果样品上的电荷更强，它就更强地被离子表面吸引，因此，它需要更长的洗脱时间。
用途:电离/指控化合物分离
基于尺寸的分色:
凝胶排阻色谱(SEC)
根据其大小，通过多孔固定相(如多糖和二氧化硅的组合)进行组分的分离。
在这一过程中，小分子样品完全渗透到固定相的孔隙中，而大分子样品可以部分渗透到孔隙中。因此，很容易传达样品中大分子比小分子先洗脱的信息。
用途:生物分子(蛋白质和碳水化合物)的分离，大分子分子量或分子分布的测定和寡聚物的鉴定，以及水溶性聚合物的分离。
来源:
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